伴随诊断流式细胞术，怎么处理样本？

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　　伴随诊断流式细胞术（FlowCytometry，FCM）能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。接下来的Protocol中以小鼠的淋巴细胞为例进行细胞表面和胞内染色。
　　一.试剂准备
　　WashBuffer：PBS+1%FBS
　　破膜剂（ICS）：用双蒸水配置10%Saponin（Sigma）。
　　破膜固定剂：将配好的ICS用4%多聚甲醛稀释100倍
　　ICSWashBuffer：将配好的ICS用WashBuffer稀释100倍。
　　二.细胞表面染色
　　收集各组细胞，进行细胞计数，加入适量WashBuffer液洗涤，1500rpm离心5min，去上清，加入50μlWashBuffer重悬。
　　（可选）Livedead染色，每管加0.1μLZombieGreenTMDye（样品多时使用时可先稀释），震荡混匀，室温避光孵育10～15min。WashBuffer液洗涤，1500rpm离心5min，弃上清。
　　封闭Fc受体：每管中加入1μg/106细胞Anti-MouseCD16/CD32抗体封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。震荡混匀，4℃孵育30min（或室温避光15min）。WashBuffer液洗涤，1500rpm，离心5min，弃上清。
　　用适量体积WashBuffer液重悬每个样本，将各组细胞等细胞数混合后分装到单染管和不染抗体管，作为流式检测时调节电压。
　　单染管中加入相应表面染色抗体，同时在每个样本中加入1μLpercpCD3/106细胞和0.5μLPECD4/106细胞，震荡混匀，4℃避光孵育30min（或室温避光15min）。
　　用WashBuffer液洗涤，1500rpm离心5min，弃上清。
　　打孔或者加入200μL1%PFA（多聚甲醛）固定过夜。
　　三.胞内染色
　　将全部管细胞固定打孔。每管加入150μL固定破膜剂，震荡混匀，4℃避光孵育20min。
　　ICSWashBuffer液洗涤，用法同WashBuffer液。
　　在相应的需要进行胞内染色的样本中加入适当量胞内染色抗体（如APCIFN-γ抗体），4℃孵育30min或室温避光孵育15min。ICSWashBuffe液洗涤，1500rpm离心5min。
　　弃离心上清液，根据实际情况加入200μL或者300μLWashBuffer液重悬。
　　震荡混匀，流式上机。
　　四.注意事项
　　每一步离心倒掉上清时可以先在实验台上铺几层平板纸，倾倒上清后可吸掉管口的液体。
　　伴随诊断为了避免打孔剂对细胞形态的影响从而影响后续圈门影响实验结果，所以不管是否需要胞内染色，每个样本都需要打孔。
　　染色时抗体的加入量可根据实际情况调整，为避免抗体浓度对染色的影响，样品染色体系不得大于100μL。为减少染色时加样的误差，可配置表面染色抗体稀释液，双染或多色染色可把多种抗体稀释到一管中。按10μL或5μL体系，用WashBuffer液稀释。
　　为了避免游离抗体的结合出现假阳性，可洗涤两次。
　　检测的细胞量不能过少也不能过多，细胞太少检测时样本流量会增大影响变异系数，细胞过多，可能会导致抗体或染料相对不足，影响实验结果。

伴随诊断流式细胞术，怎么处理样本？

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